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765 隐蔽狡猾善变（第1页）

【最近在忙新书，还有本职工作，所以修改会慢一点，大家可以等完本再看】

放疗（RT）是肺癌必不可少的治疗方式。对于不适合手术的IIIA和IIIB期肺癌患者，根治性放化疗是治疗标准，这一点已被广泛接受。不幸的是，放疗后肿瘤的再生长是成功控制疾病的主要障碍。

临床前研究表明，放疗对原发部位和转移部位的肿瘤免疫微环境具有双重作用。一方面，局部照射有可能激活针对远离照射区域的肿瘤细胞的全身免疫反应，即远隔效应，由Mole在1953年首次报道。RT促进肿瘤抗原从垂死的肿瘤细胞中释放，上调MHCI类表达，并增加多种细胞因子和免疫效应分子的表达，包括白细胞介素（IL）-1、细胞间粘附分子1（ICAM1）和血管细胞粘附分子1（VCAM1），所有这些都有助于由辐射引发的持久和全身抗肿瘤免疫。另一方面，放疗促进了肿瘤细胞的免疫逃避。例如，RT上调多种免疫抑制细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-10和转化生长因子-β（TGF-β）。RT促进免疫抑制细胞的积累，例如肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、调节性T（Treg）细胞和髓源性抑制细胞（MDSC）。辐射增强免疫检查点的活性，如程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）PD-L1、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）、T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域的蛋白3（TIM3），和淋巴细胞激活基因3（LAG3）。

为了克服放疗的免疫抑制作用，已经提出并测试了免疫疗法和放疗的各种组合。在PACIFIC研究中，标准放化疗后加入durvalumab可延长III期NSCLC患者的无进展生存期和总生存期。PACIFIC研究的巨大成功不仅改变了III期非小细胞肺癌的临床指南，也引起了其他免疫疗法与RT结合的极大兴趣。

MDSCs的积累和激活在免疫抑制的建立中起关键作用。RT对MDSCs的确切影响是复杂的。大分割照射（20Gy）抑制MDSCs的积累和浸润，而较低剂量的照射往往会促进MDSCs募集到肿瘤中。此外，临床前和临床研究表明，胃肠道肿瘤，包括结直肠癌和肝癌，在放疗后相对容易出现MDSCs水平降低，而在其他肿瘤模型和临床环境中，如胶质瘤、肺癌、乳腺癌、头颈部鳞癌、前列腺癌和宫颈癌，导致MDSC数量持续增加。蔡等人首次报道MDSCs的PD-L1表达被辐照上调。然而，关于MDSCs的确切作用，尤其是其潜在机制，在辐照后塑造TME方面知之甚少。

MDSCs是一组具有强大免疫抑制能力的异质髓细胞。根据表型和形态，MDSCs又可分为多形核MDSCs（PMN-MDSCs，又称粒细胞型MDSCs）和单核型MDSCs（M-MDSCs）。

免疫抑制活性是MDSCs的关键标志。MDSCs的抑制机制包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、精氨酸酶1（ARG1）和吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）的表达，以及一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）的产生。这些不同的机制不会同时起作用。人们普遍认为PMN-MDSCs和M-MDSCs通过不同的机制调控TME。此外，PD-L1的上调也被认为是辐射招募MDSCs的免疫抑制机制之一。目前，对于辐照诱导的MDSCs对TME的影响及放疗的治疗效果尚无一致的结论。

磷酸二酯酶-5（PDE5）抑制剂，如西地那非和他达拉非，可以阻断环磷酸鸟苷（cGMP）的水解。最新数据表明，PDE5抑制剂能够通过抑制荷瘤（TB）小鼠和患者MDSC中iNOS和ARG1的活性和表达来促进抗肿瘤免疫。然而，PDE5抑制剂如何影响MDSC的亚群以及RT和PDE5抑制剂的组合是否会延迟辐射后的肿瘤再生尚未得到测试。

我们最近的研究表明，消除招募的MDSC会延迟放疗后路易斯肺癌（LLC）的再生。在这里，我们报告了局部照射通过促进PMN-MDSC的增殖及其随后向TME的募集而削弱了抗肿瘤免疫力。ARG1的上调和激活是照射后PMN-MDSCs介导的T细胞抑制的主要机制。西地那非与放疗的组合通过抑制ARG1过表达和PMN-MDSC募集消除了辐射衍生的免疫抑制。

在TB小鼠和癌症患者中，MDSCs随着肿瘤的生长而扩增。MDSCs的两个亚群之间的比例取决于特定的肿瘤模型和微环境。为了监测同源LLC模型中MDSC的丰度，我们通过免疫表型分析确定了接种后肿瘤的生长以及LLC小鼠中不同时间点的总体MDSC及其亚群。

如图1C所示，肿瘤组织中总MDSCs的百分比随着肿瘤的发展而稳步增加，从接种后第一周肿瘤浸润淋巴细胞的不到10%（5。84±1。22%）上升到第四周超过20%（21。71±3。22%）（P<0。01）。在我们的LLC模型中，PMN-MDSCs占总MDSCs的94。94±8。47%，并且与总MDSCs具有相同的肿瘤发展趋势（P<0。05）。对亚群进行分析，虽然M-MDSCs增加了大约5倍，但差异没有统计学意义。

为了更好地了解MDSCs的全身分布，我们还研究了MDSCs在外周血、脾脏和骨髓中的比例。仅在接种LLC细胞一周后，TB小鼠外周血中的MDSC百分比是无瘤小鼠的两倍（27。33±4。62%vs。12。48±0。93%，P<0。05），3周后的MDSC百分比是无瘤小鼠的5倍（27。33±4。62%vs。12。48±0。93%，P<0。05）。TB小鼠外周血中PMN-MDSCs的比例也增加，而M-MDSCs的比例与肿瘤大小无关。

PD-L1是肿瘤细胞、MDSCs、巨噬细胞和树突状细胞表达的最重要的检查点分子之一。为了确定TB小鼠MDSCs的PD-L1表达是否与健康小鼠不同，我们通过流式细胞术测试了MDSCs的PD-L1表达。结果表明，TME中MDSCs上PD-L1的平均荧光强度（MFI）从在LLC细胞接种后的第一周386。8±100。9a。u逐渐增加到第四周的1，068。0±121。8a。u（P<0。01），这表明PD-L1在我们模型中的MDSC中具有潜在作用。

在脾脏和骨髓中，随着肿瘤的发展，MDSCs的比例也显著增加，其模式与肿瘤组织和外周血中的MDSCs相同。此外，我们在TB小鼠中观察到明显的脾肿大，这与我们观察到的MDSCs在脾内聚集一致。

为了确定局部照射对肿瘤生长和MDSCs的影响，当肿瘤直径达到7。5mm时，我们使用大分割RT（20GyF）治疗皮下LLC肿瘤。放疗导致肿瘤进展延迟长达一周，在第7至第10天的最小体积约为500mm3，但此后肿瘤开始再生。根据放疗前后肿瘤生长曲线，我们选择放疗后第3天为再生前生长，放疗后1周为肿瘤体积最小时为再生开始，放疗后2周和3周为再生阶段。肿瘤组织苏木精-伊红染色显示，与未治疗的肿瘤相比，放疗后的肿瘤中有更多的浸润性炎症细胞。随后的CD11b特异性免疫组化染色显示，大多数炎症细胞是CD11b+髓系细胞，这表明局部照射可能导致MDSCs的积累。为了证实我们的假设，我们在局部照射后的不同时间点对总MDSCs和这两个亚群进行了流式细胞术分析。局部照射后，放疗后肿瘤浸润MDSCs的比例比未治疗肿瘤高2倍（ctrlvs。RT=21。33±3。29%vs。44。10±3。00%，P<0。001）。PMN-MDSCs与总MDSCs具有相同的增加趋势（ctrlvs。RT=16。37±2。47%vs。38。66±4。24%，P<0。001），而M-MDSC比例保持在约0。1%，且与肿瘤大小和治疗无关。外周血情况同肿瘤组织。

为了确定受照射肿瘤中PMN-MDSC的逐渐积累是否有助于LLC肿瘤的再生长，或者这种积累是否仅仅是肿瘤生长的结果，使用抗Ly-6G单克隆抗体来消耗MDSC。抗Ly-6G抗体的应用显着降低了肿瘤部位和外周血中PMN-MDSC的频率（P<0。05）。此外，用抗Ly-6G抗体治疗大大延迟了照射后的再生，这表明PMN-MDSC的募集对肿瘤再生至关重要。

虽然PMN-MDSCs利用一系列机制来抑制抗肿瘤免疫反应，这涉及到许多免疫细胞和细胞因子，但对CD8+T细胞的抑制无疑是最重要的。为了确定RT后PMN-MDSCs诱导的免疫抑制是否依赖于CD8+T细胞，我们通过流式细胞术评估了CD8+T细胞的数量和功能。

如图3D所示，CD8+T细胞的百分比随着照射从11。71±2。31%下降到2。42±0。62%（P<0。01）。PMN-MDSC耗竭逆转了这种下降（RTvs。RT+anti-Ly-6G抗体=2。42±0。62%vs。20。12±3。92%，P<0。01）。为了更好地了解CD8+T细胞浸润肿瘤部位的功能状态，我们测量了CD8+T细胞内部和表面上IFN-γ、CD28和PD-1的表达。局部RT显着降低了CD8+T细胞分泌IFN-γ的比例，从33。064。53%降至13。252。08%，并增加了表达PD-1的CD8+T细胞的比例（ctrlvs。RT=253。20±57。03auvs。538。80±98。76）au，P<0。05）。

CD28表达未观察到显着变化。当抗Ly-6G抗体被给予辐照小鼠时，IFN-γ分泌达到与未处理的LLC小鼠相同的水平（29。74±3。55%），而与辐照小鼠进行比较抗Ly-6G抗体处理后的PD-1表达没有变化小鼠。因此，在这部分我们建议PMN-MDSCs通过抑制CD8+T细胞促进放疗后肿瘤的再生。PMN-MDSCs不仅抑制了TME中CD8+T细胞的数量，而且还抑制了其活性。

为了确定辐照诱导MDSCs的抑制机制，我们进行了免疫组化染色及iNOS和ARG1活性检测。肿瘤切片的免疫组化染色显示，局部RT增强了ARG1的表达，但没有增强iNOS的表达。ARG1活性测定表明，局部照射显著提高了ARG1的活性，从0。400。15UL提高到3。780。39UL（（P<0。01）。相比之下，NO荧光标记的iNOS活性检测显示，辐照和未处理的肿瘤组织样本的荧光强度相似。

PD-L1的表达是MDSCs的一种新型免疫抑制机制。然后我们询问PD-L1上调是否是RT后MDSCs介导的免疫抑制的机制之一。通过流式细胞术分析辐照后MDSC中PD-L1的表达。图4E显示，与未处理组相比，受照射肿瘤的MDSC中的PD-L1表达在照射后不久显着增加（照射后第三天：ctrlvs。RT=443。9±175。3auvs。1328。0±324。3au，P<0。05）。然而，此后PD-L1表达继续下降，局部照射组在照射后第3周显着低于未治疗组（ctrlvs。RT=1，465。0±399。6auvs。407。5±164。8au，P<0。05）。外周血中MDSCs的PD-L1表达与局部肿瘤部位的表达趋势相同。

以上数据表明ARG1表达的上调是照射后PMN-MDSCs抑制功能的合理机制。然而，不涉及PD-L1和iNOS的调节。为了进一步证实这一假设，在辐射后通过灌胃给予ARG1抑制剂nor-NOHA。10mgkgdnor-NOHA有效地将ARG1活性从3。780。39UL降低到2。020。25UL（P<0。01）。

RT后给予nor-NOHA显着增加CD8+T细胞比例（RTvs。RT+nor-NOHA=2。420。62%vs。6。140。64，P<0。01），并伴有肿瘤再生延迟。iNOS抑制剂1400W对肿瘤再生长没有影响。

我们的结果表明，RT通过上调肿瘤内PMN-MDSC的百分比和ARG1活性来促进肿瘤免疫逃避。推测抑制PMN-MDSCs及其ARG1活性可能是一种新的抗肿瘤策略是合理的。越来越多的证据表明，PDE5抑制剂可以抑制TB小鼠和癌症患者MDSC中iNOS和ARG1的活性和表达。因此，通过灌胃给予西地那非20mgkgd，以研究它是否可以促进RT的抗肿瘤作用并阐明潜在机制。如图5B所示，正如我们预期的那样，西地那非延迟了照射后的肿瘤再生长，这与阳性对照Nor-NOHA相当。TME的免疫特征表明，当给予西地那非时，肿瘤内PMN-MDSC的比例从38。66±4。24%下降到23。57±2。38%。

此外，西地那非也显着降低了ARG1的表达。为了进一步检查西地那非对MDSC的抑制是否真的导致抗肿瘤免疫增强，我们分析了肿瘤内CD8+T细胞的比例和活性。流式细胞术分析表明CD8+T细胞的百分比从2。42±0。62%增加到7。21±1。22%。

此外，当给予西地那非时，CD8+T细胞分泌的IFN-γ也显着升高。因此，我们证实PDE5抑制剂西地那非通过调节PMN-MDSCs改善了照射后肿瘤免疫微环境。西地那非联合放疗可能是提高放疗疗效的一种有前景的策略。

工作揭示了PMN-MDSCs中ARG1通路介导RT后肿瘤再生的新机制，如图6所示。我们认为，PMN-MDSCs是辐照招募的主要亚型，而不是M-MDSCs。在广泛的免疫抑制机制中，ARG1的上调和激活是PMN-MDSCs在放疗后抑制CD8+T细胞的主要机制。为了克服PMN-MDSCs引起的免疫抑制，我们提出并证明，sildenafil和RT联合使用降低了PMN-MDSCs在TME内的募集和免疫抑制作用，激活了CD8+T细胞应答，导致肿瘤生长延迟。综上所述，我们的研究结果为缓解免疫抑制TME以提高RT治疗效果提供了一种新的解决方案。虽然所有这些结果都是在LLC小鼠模型中进行的，但同样的机制是否适用于其他肿瘤模型尚不清楚。此外，在不同的辐射方案下，MDSCs及其亚型如何影响TME仍未确定。因此，这些问题还需要进一步的研究来解决。

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